Результаты исследования пептидов животного происхождения на выявление прионов
В 2012 году российскими учеными было проведено тестирование на выявление прионов в пептидах животного происхождения. Исследование пептидов было выполнено в лаборатории патоморфологии вирусных инфекций НИИ гриппа РАМН. Было исследовано сырье для производства биологически активных добавок к пище — пептидные комплексы с молекулярной массой до 10 кДа, которые были выделены из органов и тканей молодых животных, таких как свиньи и телята. Тестирование пептидов на наличие прионов проводили по утвержденной в России (1) и рекомендованной ВОЗ (2) методикам:
- 1. «Методические указания по патогистологической диагностике прионных инфекций». Минсельхозпрод РФ, Департамент ветеринарии, N 13-7/929, утверждены начальником Департамента ветеринарии Авиловым В.М. 06.05.1997 г.
- 2. Отчет о консультации ВОЗ по вопросам общественного здравоохранения, связанным с трансмиссивными губкообразными энцефалопатиями человека и животных / Женева, 17-19 мая 1995 г. / Ветеринарная группа общественного здравоохранения ВОЗ.
Углубленное исследование образцов проводили наиболее чувствительными методами выявления прионовых белков: иммуноблотинга с применением тест-системы фирмы "Prionics AG" и электронной микроскопии.
Обоснование исследования
Общие положения
Прионные инфекции - медленно прогрессирующие болезни животных (скрэпи овец, спонгиформная энцефалопатия крупного рогатого скота) и человека (куру, болезнь Крейцфельда-Якоба), протекающие с симптомами поражения центральной нервной системы и неизбежно заканчивающиеся летальным исходом.
Инфекционные агенты, вызывающие заболевания этой группы, — инфекционные прионы, обозначаемые PrPSc, представляют собой патологическую форму нормального клеточного белка, в норме присутствующего в клетках организма млекопитающих, обозначаемого PrPC. Агрегаты прионного белка в зараженных клетках по структуре и свойствам близки к амилоидному белку, но в отличии от последнего устойчивы к протеолитической обработке. Молекулярные массы всех обнаруженных до настоящего времени прионных белков укладываются в интервал от 20 до 31 кДа.
Методы выявления прионов
Агрегаты прионов в ткани или пробах сырья (пептидов) могут быть выявлены гистохимически с помощью красителя Конго-красного. Окрашенный препарат наблюдают на темном фоне при скрещенных поляризаторах. Амилоидные агрегаты проявляются в виде светящихся волокон и сгустков зеленого и изумрудно-зеленого цвета. Данная методика рекомендована ВОЗ и Департаментом ветеринарии РФ в качестве первичного скринингового метода выявления прионных инфекций и тестирования препаратов животного происхождения.
Более мелкие агрегаты отдельных молекул прионов, не выявляемые гистохимическим методом, могут быть обнаружены при помощи методов электронной микроскопии в виде так называемых прионных палочек и скрэпи-ассоциированных фибрилл (САФ) при увеличении микроскопа х30000 - х50000. Обработка образцов исследуемого сырья протеиназой К позволяет дифференцировать инфекционные прионные белки от неинфекционных (клеточных) и от похожих по внешнему виду структур. В сочетании с методами концентрирования прионов электронная микроскопия является более чувствительным методом, чем гистохимическое окрашивание.
Наиболее чувствительным методом обнаружения прионов является иммуноблотинг с применением моноклональных антител к PrPSc и PrPC. Метод используется в исследовательских целях и для коммерческого тестирования мясопродуктов на прионные инфекции в странах ЕС.
Материалы и методы
Исследованы образцы сырья (пептидов) для производства биологически активных добавок к пище. Образцы представляют собой порошки кремового цвета, упакованные в целлофановые пакеты термосваренные. Выявление прионных белков в исследуемых образцах сырья проводили методами гистохимии, электронной микроскопии и иммуноблотинга.
Гистохимическое окрашивание
Зафиксированный спиртом на предметном стекле исследуемые образцы окрашивали 1% водным раствором красителя Конго-красного в течение 3 часов по стандартному методу Пирса. Затем образцы обрабатывали в течение 60 секунд 1% раствором йодида калия и отмывали от не связавшегося красителя в 70% спирте трижды по 10 минут с заменой спирта. Просмотр образцов производили в темном поле при скрещенных поляризаторах при увеличении х300 - х600. В качестве положительного контроля использовали гистологические препараты амилоидной почки человека.
Электронная микроскопия
Для повышения чувствительности электронно-микроскопического исследования проводили концентрирование фракции агрегированного белка в исследуемых образцах путем 3-кратного замораживания-оттаивания насыщенного раствора сыряь. Затем по 5 мл раствора каждого из исследуемых образцрв центрифугировали при 120000 g в течение 2 часов на ультрацентрифуге L-8 ("Beckman", США). Полученный осадок разводили в 50 мкл бидистиллированной воды. Таким образом достигали примерно 200-кратной концентрации той фракции сырья, которая могла содержать прионы. Сконцентрированный, описанным способом, осадок агрегированного белка наносили на формвар-углеродные подложки и подвергали протеолитической обработке протеиназой К ("Sigma", США) в концентрации 0,2 мг/мл в течение 20 мин при температуре 37 °С. Подложки контрастировали 1,5% раствором фосфорно-вольфрамовокислого натрия (рН 6,7) и просматривали под электронным микроскопом (модель JEM-100S, JEOL, Япония) при инструментальном увеличении х30000 - х100000 с целью выявления наличия «прионных палочек» и САФ. В качестве положительного контроля использовали прионы дрожжей, сходные по морфологии и протеолотической устойчивости с прионами млекопитающих.
Иммуноблотинг
Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой, прилагаемой фирмой "Prionics" к тест-системе с моноклональными антителами к PrPSc и PrPC. Исследуемые образцы гомогенизировали в саркозиловом буфере до концентрации 10%, денатурировали SDS-меркаптоэтаноловым буфером, после чего наносили в количестве 10 мкл на поверхность полиакриламидного геля в кассете (Mini Protean II, "Biorad", США). Электрофорез проводили при напряжении 80 V в течение 2 ч. Одну из полученных пластин красили по Кумасси, с другой производили электроперенос материала на высокоемкую синтетическую мембрану PVDF при напряжении 40 V в течение 10 ч при температуре 4 °С (Transfer tank, "Biorad", США). Распределение белка на мембране производили с помощью уксуснокислого раствора "PonceauS" в течение 2 мин, затем мембрану блокировали буфером BLOCK (PRIONICS check-kit) в течение 1 ч при комнатной температуре. Инкубирование с моноклональными антителами 6Н4 (1:2500) производили в течение ночи при температуре 4 °С. После инкубирования со вторыми антителами (goat-antimouse) сигнал выявляли хемилюминесцентным субстратом NBT/BCIP в соответствии с рекомендациями производителя.
Результаты исследования
Гистохимическое окрашивание
При исследовании образцов сырья (пептидов) для производства БАД , амилоидоподобных агрегатов белков, в том числе прионов не выявлено. После окрашивания исследуемых образцов в темном поле не наблюдалось никаких светящихся агрегатов. При исследовании положительного контрольного образца амилоидной почки наблюдались характерные волокнистые агрегаты амилоида с желто-зеленым свечением.
Электронно-микроскопическое исследование
При электронно-микроскопическом исследовании концентрированных осадков представленных образцов прионных структур в виде так называемых «прионных палочек» и скрэпи-ассоциированных фибрилл не выявлено. На угольных подложках обнаруживались только следы сорбции низкомолекулярных соединений. На положительном контрольном препарате прионы дрожжей выявлялись в виде характерных фибриллярных структур — САФ.
Иммуноблотинг
При проведении электрофореза с моноклональными антителами к прионным белкам (клеточному и инфекционному) ни в одном из представленных образцов не было выявлено белков с молекулярной массой выше 20 кДа (молекулярная масса прионных белков — 27-30 кДа). После инкубации мембраны PVDF с исследуемыми образцами без обработки протеазой К, с антителами 6Н4 и окрашивания в образцах никаких брендов связывания не выявлено. Таким образом, методом иммуноблотинга прионных белков в исследуемых образцах не обнаружено.
Заключение
С целью выявления прионных белков в образцах сырья (пептидов) для производства БАД, в лаборатории патоморфологии вирусных инфекций НИИ гриппа РАМН были проведены исследования диагностическими методами, рекомендованными ВОЗ и утвержденными Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ: гистохимическим, электронно-микроскопическим и иммуноблотинга с использованием моноклональных антител к прионным белкам.
Ни одним из перечисленных методов наличия прионов в образцах сырья не выявлено.